Programmed cell death

Bahan Biosinyal : Developmental Signal
By
Fatma Hastuti

Siklus sel dibagi menjadi 4 fase, yaitu fase S (Sintesis), Fase G2, Fase M (mitosis), dan Fase G1. Tubuh memiliki 3 checkpoint selama siklus sel: G1 checkpoint, G2 checkpoint, dan M2 checkpoint. Dua protein utama yang mengatur siklus sel, yaitu:
1. cdk (cyclin dependent protein kinases); protein ini aktif jika difosforilasi
2. Siklin (Cyclin); berikatan dengan cdk membentuk kompleks cdk-cyclin bertujuan mengontrol fosforilasi protein target tertentu dalam siklus sel
 Siklin mitotic/ siklin B : berikatan dengan cdk selama G2 dan diperlukan sel untuk dapat masuk ke mitosis, kompleks siklinM-cdk menghasilkan MPF (M-phase Promoting Faktor)
 Siklin G1 : berikatan dengan cdk selama G1 dan diperlukan sel untuk masuk ke fase S
 Siklin S: diperlukan untuk inisisasi replikasi DNA
Pengaturan siklus sel dengan cara fosforilasi dan defosforilasi MPF
Siklus sel diatur oleh mekanisme pasca transkripsi dengan regulasi cdk, ubiquitin dan protein target ubiquitin ligase. Sistem pengontrol menentukan apakah sel terus melangsungkan siklusnya atau keluar dari siklus untuk masuk ke Go. Terdapat faktor eksternal dan internal yang menentukan siklus sel. Gangguan pada siklus sel dapat menyebabkan sel masuk ke dalam tahapan kematian sel secara terprogram (apoptosis). Gen yang berperan dalam mengatur pembelahan sel adalah protoonkogen dan tumor supressor gen.
Protoonkogen merupakan gen yang memproduksi protein yang berperan dalam menginduksi pembelahan sel. Mutasi pada protoonkogen menghasilkan onkogen. Gen tumor supresor merupakan gen yang mengkode protein yang berperan dalam menghambat pembelahan sel.
Faktor luar yang berperan dalam siklus sel adalah mitogen (menstimulasi pembelahan sel dengan induksi aktivitas G1/S-cdk), faktor tumbuh (PDGF, EGF yang menstimulasi pertumbuhan sel dan menghambat degradasi protein yang beran dalam pertumbuhan), faktor pertahanan yang memungkinkan kelulushidupan sel dan mencegah apoptosis. Dalam kondisi normal, apoptosis dan proliferasi sel harus berada dalam kondisi seimbang.
Terganggunya sistem pengontrolan siklus sel dapat menyebabkan sel tidak keluar dari siklus dan tidak berdifrensiasi, terjadi proliferasi sel terus-menerus sehingga terbentuk kanker. Apoptosis perlu terjadi pada saat tahap perkembangan atau pada organisme dewasa, sebagai contoh yaitu pada pembentukan jari tangan atau keseimbangan jumlah sel. Pada sumsum tulang dan usus orang dewasa terjadi kematian sel secara terprogram setiap jam.
Terdapat 2 mekanisme kematian sel : nekrosis dan apoptosis. Nekrosis ditandai dengan terjadinya edema sel, dan perubahan mitokondria yang awalnya reversibel menjadi irreversibel, sehingga terjadi pemecahan membran sel dan seluruh isi sel berhamburan keluar dari sel. Sedangkan apoptosis ditandai dengan terjadinya pengerutan sel, benjolan-benjolan pada membran, kondensasi kromatin dan isi sel lainnya menjadi badan-badan apoptotik, tanpa disertai dengan pecahnya membran sel. Kerusakan membran sel baru terjadi pada fase akhir apoptosis.
Nekrosis merupakan kematian sel yang disebabkan oleh kecelakaan, dihubungkan dengan keadaan nonfisiologis yang mengganggu homeostasis seluler, seperti: iskemia, hipoksia, dan keracunan. Nekrosis disebabkan oleh dissolusi membran, yaitu lisis osmosis, shear stress, protein pembentuk pori, dan terjadi kehilangan ATP. Nekrosis merupakan peristiwa buruk sel karena terjadi pembebasan enzim-enzim degradatif di sekitar jaringan, biasanya menyebabkan reaksi peradangan.
Apoptosis merupakan kematian yang telah dirancang oleh sel sehingga dikenal dengan sebutan programmed cell death. Apoptosis diinduksi oleh sintesis gen baru yang diawali respon oleh sinyal-sinyal pengembangan (developmental signal). Apoptosis memerlukan sintesis protein dan RNA, yaitu inhibitor faktor transkripsi atau translasi dapat mencegah apoptosis. Apoptosis penting untuk pengembangan, homeostasis, dan eliminasi sel patogen dan sel tumor; menyebabkan hilangnya individu sel; diikuti dengan fast fagositosis; dan anti-inflamasi (housekeeping).
Perubahan morfologis selama apoptosis adalah membran menjadi irregular, kromatin terkondensasi dan bersegregasi, terjadi juga kondensasi sitoplasma, DNA terfragmentasi (diakibatkan pengaktifan enzim proteolisis dan endonuklease sehingga memfragmentasi DNA), dan akhirnya sel menjadi badan-badan apoptotik kemudian difagositosis oleh sel parenkim, sel fagositosis, atau sel tetangganya. Terdapat 3 fase apoptosis, yaitu fase induksi, fase eksekusi atau efektor, dan fase degradasi. Teknik untuk mengenali apoptosis di antaranya penaksiran morfologis, pengukuran transglutaminase jaringan, pengukuran DNA terfragmentasi, laju sitometri sel apoptosis, dan probe spesifik dari sel apoptosis seperti Annexin V.
Mekanisme kematian sel secara apoptosis sebenarnya memang berada di dalam inti sel, berupa gen ced-3 dan ced-4 (ced, cell death). Gen pro-apoptosis ini mengkode sintesis berbagai protease yang disebut sebagai caspases (cysteine-dependent aspartatespecific protease) - besar peranannya dalam proses cascade of proteases (proteolitik intrasel) pada waktu terjadinya apoptosis. Caspases berada dalam sel dalam bentuk enzim zomogen yang tidak aktif, tetapi sewaktu-waktu dapat diaktifasi menjadi aktif dan menyebabkan proteolitik intrasel. Pada sel manusia, sudah dapat diidentifikasi sekitar 14 enzim caspases; sebagian bersifat sebagai inisiator proapoptotik dan sebagian lagi sebagai inhibitor yang bersifat anti-apoptotik. Caspases 8 dan 9 merupakan caspase sinisiator, caspases 3 adalah caspases efektor. Protein ced-3 dan ced-4 yang dibentuk oleh gen ced-3 dan ced-4, merupakan efektor terakhir yang akan menstimulasi proses apoptosis. Pada vertebrata, Bcl-2 berperan sebagai regulator, Apaf-1 berperan sebagai Adapter, dan Casp 3 sebagai efektor dari kematian sel.berikut adalah gambar aktivasi procaspase:

Gambar 1 Tahapan aktivasi procaspase.
Proses apoptosis dapat teraktifasi melalui jalur ekstrinsik atau external signal (Death receptor pathway, contoh: reseptor TNF dan Fas), dapat pula melalui jalur intrinsik atau intrinsik signal ( mitochondrial pathway /cytochrome-c mitokondria). Melalui jalur ekstrinsik, berbagai sinyal intrasel – seperti protein death domains (DD) dan death effector domains (DED) - akan mengaktifasi caspase- 8, selanjutnya sampai pada caspase-4 dan mengaktifasi caspase-3 sebagai efektor proses apoptosis. Jalur intrinsik akan meneruskan sinyal cytochrome-c yang keluar dari mitokondria melalui protein sinyal intrasel Bcl-2 yang bersifat antiapoptosis atau melalui protein sinyal Bax yang bersifat proapoptosis untuk mengaktifasi caspase-9. Apabila Bcl-2 lebih dominan dari Bax, maka caspase-9 yang diaktifasi akan berikatan dengan caspase-4, sehingga mencegah aktifasi caspse-3 dan proses apoptosis pun tidak terjadi. Tetapi apabila protein Bax lebih dominan, maka sinyal apoptotik akan diteruskan melalui caspase-9 yang akan mengaktifasi langsung caspase-3 sebagai efektor apoptosis.

Gambar 2 Jalur intrinsik apoptosis.
Apoptosis memiliki peranan penting dalam perkembangan sel normal. Pada sistem imun, apoptosis memiliki aturan fisiologi spesifik yang eksklusif untuk kebutuhan fungsi sistem tersebut. Sebagai contoh tanggung jawab untuk penghapusan sel-sel T autoreaktif dalam thymus bertanggungjawab untuk batas toleransinya sendiri dan untuk seleksi sel-sel B dalam pusat germinal limfoid selama respon imune humoral. Fungsi spesialis lain adaptasi dalam hewan normal adalah menghapus sel-sel yang tak berguna, seperti leukosit netropil yang tua dan megakaryosit yang telah menumpahkan sitoplasmanya selama pembentukan platelet.
Jika DNA rusak, maka produk gen p53 ditingkatkan pada sel tersebut, mengakibatkan berhentinya siklus G1, dan terjadi perbaikan pada sel tersebut. Namun, bila p53 ini gagal bekerja, maka p53 akan menginduksi apoptosis pada sel tersebut. Induksi apoptosis bisa oleh APO-1, fas, dan juga limfosit sitotoksik. Induksi apoptosis oleh sel-sel T sitotoksin tidak dihambat oleh penghambat sintesis protein atau oleh ekspresi bcl-2.
Antigen APO-1 merupakan antibodi monoklonal yang meningkat pada sel limfoblast B manusia. Satu dari antibodi yang telah ditemukan menginduksi apoptosis yang diaktifkan imfosit B dan T manusia dan bermacam-macam sel dari derivat sel tumor limfoid manusia. Antigen membran sel dimana antibodi ini melekat dibari nama APO-1. Antigan FAS, didefinisikan sebagai suatu antibodi monoklonal. Molekul ini memiliki reseptor faktor nekrosis tumor manusia/ reseptor faktor pertumbuhan syaraf yang merupakan famili dari protein permukaan sel.
Aktivasi mekanisme apoptosis untuk tiap sel tertentu disebabkan oleh aktivitas yang berbeda-beda pula. Apabila terjadi aktivitas stimulus terhadap sel dan aktivitas apoptosis , akan terjadi peningkatan kadar ion Ca++ didalam inti sel. Ion Ca++ ini mengaktifkan enzim Kalsium dependen Nuklear Indo Nuklease yang terdiri dari Endonoklease , Protease Transglutaminase. Beberapa gen bila distimulasi akan menyebabkan apoptosis, seperti Heta shock protein dan proto onkogen. Tetapi stimulasi gen ini tidak berhubungan langsung dengan proses mulainya apoptosis.
Pada fase inisiasi, dapat diaktivasi oleh stimulus yang berbeda-beda. Misalnya, pengikatan FasL pada reseptor Fas, menghasilkan oligomerisasi fas sehingga bagian intraselular dari Fas akan menggumpal yang disebut dengan Death Domain, kemudian terjadi perekrutan protein FADD yang juga mengandung Death Domain. FADD ini berperan sebagai molekul adaptor yang merekrur caspase yang juga memiliki Death Effector Domain sehingga mudah dalam merekrut procaspase-8. Faktor lain yang berperan dalam inisiasi apoptosis adalah reseptor TNF (TNFR), CD27, CD30, CD40, DR3, DR4 dan DR5. Seperti halnya molekul CD95, molekul TNFR1, DR3, DR4 dan DR5 juga memiliki “death domain”, walaupun masing-masing meneruskan sinyal apoptosis melalui jalur yang berbeda. pada literatur lain, mekanisme Fas-FasL apoptosis sebagai respon terhadap stimulasi antigenik, ekspansi periferal sel T, yang mana sel T akan meningkatkan regulasi via Fas-FasL apoptossis.

Gambar 3 Fas-FasL apoptosis.

Gambar 4 Pembentukan Death Initiating Signal Complec (DISC).
Sinyal TNF akan berikatan dengan TNFR akan merekrut protein TRAF, yang mana protein ini tidak mengandung Death Domain, kemudian terjadi perekrutan protein TRAP, C-IAP, dan TRIP. Dalam hal ini TRAF sama seperti FADD, yaitu sebagai molekul adaptor sinyal.

Gambar 5 Jalur Ekstrinsik apoptosis.
Apoptosis juga dapat berlangsung melalui reseptor sel T (TCR). Hal ini terjadi apabila sel T mengenali antigen-diri (self antigen) dan merupakan suatu proses yang diperlukan untuk menyingkirkan sel T autoreaktif.3 Apoptosis ini disebut apoptosis yang diinduksi aktivasi (activation induced apoptosis).

Gambar 6 Jalur intrinsik dan ekstrinsik apoptosis.
ALG-3 dan NFAT merupakan regulator positif ekspresi FasL selama apoptosis dengan perantaraan TCR/CD3, sedangkan RAR (retinoic acid receptor) menghambat proses ini. ZAP-70 dan Lck merupakan enzim kinase yang merupakan pengatur jalur sinyal melalui TCR
Pengendalian apoptosis dihubungkan dengan gen yang mengatur siklus sel, termasuk di antaranya gen p53, Rb, myc dan lain-lain. berbagai jenis gen berfungsi sebagai penghambat apoptosis, di antaranya keluarga bcl2 dan beberapa jenis onkogen virus yang dikenal memiliki potensi untuk mengakibatkan transformasi sel menjadi ganas
Fungsi produk gen p53 dan Rb terkait erat dengan peristiwa dalam siklus sel pada fase G1. Gen retinoblastoma (Rb) mencegah berlangsungnya siklus sel pada fase G1/S dengan menghambat fungsi faktor transkripsi E2F dan dengan demikian menghambat fungsi berbagai gen yang bekerja pada fase S, termasuk di antaranya myc, myb, dan DNA polimerase α. Sebagian besar partner Rb1 dalam mengatur siklus sel adalah regulator transkripsi seperti E2F, c-Abl dan Mdm2. Mdm2 merupakan salah satu faktor yang menghambat apoptosis. Pada saat apoptosis Mdm2 mengalami degradasi oleh caspases. Pada induksi apoptosis terjadi cleavage pada C-terminal molekul Rb oleh caspases sehingga terjadi akumulasi ΔRb1. Fragmen ΔRb1 ini secara biologis tetap aktif karena domain fungsional minimal Rb1 sebagai gen supresor terletak pada bagian ini, sehingga apoptosis lebih banyak diasosiasikan dengan kehilangan seluruh rantai Rb1 dan tidak bergantung pada akumulasi ΔRb1. Adanya degradsi Rb1 menjadi ΔRb1, membuat ΔRb1 kehilangan kemampuan dalam mengikat Mdm2 sehingga Mdm2 didegradasi oleh caspase. Terjadinya degradasi Rb dan Mdm2 oleh caspase menyebabkan aktivasi E2F-1 dan p53, sehingga menginduksi apoptosis.
Perombakan Rb1 di-katalisasi oleh upstream caspase(s) yang tidak memiliki kemampuan untuk membunuh sel sehingga harus dirombak oleh caspase(s) yang mampu membunuh sel (death effector caspases). Pada apoptosis yang diinduksi oleh Fas/FasL death effector caspases diaktivasi melalui jalur yang tidak bergantung pada Rb1. Preservasi Rb1 melalui ekspresi ΔRb1 tidak berdampak pada apoptosis melalui jalur Fas/FasL, tetapi pada induksi melalui TNF-αR, upstream caspases diaktifkan untuk merombak Rb1, walaupun mekanisme ini tidak cukup efisien untuk menghasilkan kematian sel. Degradasi selanjutnya bersama-sama dengan perombakan Mdm2 mengakibatkan aktivasi E2F dan p53. Ekspresi Rb1 mutant yang resisten terhadap perombakan oleh caspases melindungi E2F dan mencegah degradasi Mdm2, sehingga aktivasi death effector caspases terhambat dan tidak terjadi apoptosis. Dalam konteks ini Rb1 merupakan substrat penting bagi caspases.
Dalam fungsinya myc membentuk heterodimer dengan gen max.. Kompleks onkoprotein myc-max meningkatkan apoptosis bila sel kehilangan faktor pertumbuhan, atau bila ada intervensi farmakologis.24 Dimerisasi myc-max diperlukan baik untuk proliferasi maupun apoptosis. Walaupun demikian myc dan max masing-masing memodulasi jalur apoptotik yang berbeda. Hal ini dibuktikan dalam suatu penelitian yang menyatakan bahwa Bcl-xL menghambat apoptosis sel yang mengekspresikan max berlebihan tetapi tidak pada sel-sel yang mengekspresikan c-myc berlebihan.
Gen Bcl 2 dikenal sebagai inhibitor apoptosis . gen bcl2 menghambat kemampuan c-myc untuk menginduksi apoptosis. Tidak semua apoptosis dapat dihambat oleh gen bcl2. Induksi apoptosis oleh TNF tidak dapat dihambat oleh bcl2. Gen bcl2 termasuk keluarga gen yang beberapa anggota keluarganya bersifat menghambat apoptosis (Bcl2, Bcl-x1, Mcl1 dan lain-lain), tetapi beberapa anggota keluarga yang lain ternyata bersifat memudahkan apoptosis (Bax, Bcl-xs, Bad, Bak, dan lain-lain). Keluarga Bcl-2 ini sangat banyak, saat ini terdapat 19 anggota yang telah teridentifikasi. Bcl-2 adalah protein homolog dengan Ced-9 yang merupakan prototype semuan domian BH3 homologi dengan Bcl-2. BH3 merupakan domain proapoptosis yang terekpos pada aktivasi. Bid, Bax, dan lipid bekerjasama membentuk supramolekular untuk membuka membran luar mitokondria.
Faktor lain yang berperan pada apoptosis adalah cytochrome-c. Penglepasan cytochrome-c oleh mitokhondria tidak bergantung pada caspases, dan dampaknya tidak selalu diasosiasikan dengan terjadinya pori pada membran mitokhondria. Atas rangsangan apoptosis, bax yang merupakan faktor proapoptotik segera berpindah tempat dari sitoplasma ke mitokhondria dan secara langsung dapat menginduksi penglepasan cytochrome-c melalui pori yang dibuatnya pada membran mitokhondria. Apabila aktivasi caspase-8 melalui cara ini inefisien, ditempuh jalur lain yaitu melalui Bid, faktor proapoptotik anggota keluarga bcl2 yang lain. Bid segera mengalami cleavage dan fragmen C-terminalnya segera merangsang mitokhondria untuk melepaskan cytochrome-c. Caspase-8 yang teraktivasi (misalnya karena pengikatan Fas/FasL) memecah Bid, menghasilkan fragmen C-terminal yang kemudian melekat pada mitokhondria dan menginduksi penglepasan cytochrome-c. Cytochrome-c kemudian berfungsi mengatifkan Apaf-1 (apoptosis protease activating factor) dan pemrosesan caspases-9 yang selanjutnya mengaktifkan kaskade caspase yang lainnya. Bcl-2/bcl-xl berfungsi menghambat penglepasan cytochrome-c dan dengan demikian menghambat apoptosis.